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聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白

  聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白_生物学_自然科学_专业资料。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白 电泳基本原理: 电泳是指带电粒子在电场的作用下,发生定向泳 动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析 的技术。 蛋白质N端游离氨基,C端游离羧基以

  聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白 电泳基本原理: 电泳是指带电粒子在电场的作用下,发生定向泳 动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析 的技术。 蛋白质N端游离氨基,C端游离羧基以及侧链 上一些基团在一定pH条件带电荷, 因此可以 用电泳技术分离和鉴定。 COO╱ + H+ Pr ←————→ ╲ + OH- NH2 COO- COOH ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI 带电粒子的迁移率 电场力 F=XQ (X:电场强度, Q:电荷量) 阻力 F=6πγηυ (γ:半径,η:介质粘度) 当电泳颗粒匀速运动: F= F QX=6πηγν ν/X=Q/6πηγ ν/X 用U表示,称迁移率(mobility) 即单位电场强度时粒子运动的速度,取决 于带电粒子的电荷量Q 、粒子大小γ和形状。 Q越多,V越大;r越小,V越大;球形分子 纤维状 影响电泳速度的因素: ? 样品本身:带电量,分子大小,形状 ? 电场强度:电压 ? 电泳介质的pH和离子强度 ? 电渗作用 聚丙烯酰胺凝胶电泳分类 按凝胶装置分为盘状电泳及板状电泳 盘状电泳通常是不连续系统,利用缓冲液离子成分、 pH、凝胶孔径进行电泳,带电颗粒电泳时具有电荷 效应、分子筛效应、 浓缩效应。 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG) 的聚合反应: 以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝 胶是单体聚丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯 酰胺(Bis)交联而成的,催化剂为过硫酸铵(AP), 加速剂为四甲基乙二胺TEMED, 形成三维网状凝 胶。 三大效应:浓缩效应 ? 缓冲液离子成分、PH的不连续性:电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸 缓冲液,样品及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的 pH=8.3,甘氨酸的电离小,有效迁移率小,称为慢离子;浓缩胶中的氯 离子完全电离,有效迁移率大,称为快离子;蛋白质在浓缩胶中介于二者 之间。电泳开始后,氯离子跑得最快,留下一段低电导区,产生高电位梯 度(电位与电导率成反比),使甘氨酸离子追赶氯离子,蛋白质夹在中间 而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的厚度。 电泳缓冲液 样品 浓缩胶 分离胶 成分 甘氨酸(慢离子) 蛋白质 Cl-(快离子) Cl-(快离子) pH值 8.3 6.7 6.7 8.9 孔径 大 小 有效迁移率 = 迁移率 解离度 分子筛效应:分子量或分子大小和形状不同的蛋白质 通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出 不同的迁移率,这就是分子筛效应。当样品进入分离 胶,凝胶孔径变小,分子量小,阻力小,移动快;分 子量大,阻力大,移动慢。 电荷效应:电荷量不同,迁移率不同。 实验步骤 1.制备PAGE胶柱 画线cm两处画线, 此 端管口插入橡皮垫。 制备分离胶:配制好7.5%分离胶,缓慢注入玻璃管 7cm处,加水防止氧化,室温下聚合 聚合20-30min。 制备浓缩胶:配制好3%浓缩胶。将胶上层水倾倒出 去,用滤纸吸干余水。加浓缩胶,封 水。室温下聚合20-30min。 2. 上样和电泳:将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞 孔中,加入电极缓冲液与下电泳槽,随后放入凝 胶管及上槽,除气泡, 加样品液50μl至浓缩胶面。 加电解液直至装满上电泳槽。电泳约1.5hr。 3. 染色,观察结果:将胶从玻璃管中取出,注意 不要弄断凝胶。凝胶考马斯亮蓝染色,然后脱色,福建体彩网, 脱色至背景清晰。观察结果。 结果示意图: γ β α2 α1 清蛋白 注意事项: 1.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂, 对皮肤有刺激作用,注意避免直接接触。 2.制胶时,要充分摇匀,加速剂TEMED最后加。 3.注意观察实验现象:分界面,浓缩效应. 4. 氨基黑染色﹑脱色﹑染液回收。 5.固体胶切忌倒入水池。

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