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福建体彩网血清蛋白的聚丙烯酰胺电泳

  血清蛋白的聚丙烯酰胺电泳._生物学_自然科学_专业资料。血清蛋白的聚丙烯酰胺电泳.

  实验九 血清蛋白聚丙烯酰胺 垂直板电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis,缩写为PAGE) 一、实验目的 *学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 *掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术 二、实验原理 (一)电泳的含义 带电的胶粒或大分子在外加电场中,向带相反电荷 的电极作定向移动的现象称为电泳。 电泳的应用 1. 分离各种有机物:如蛋白质、酶、核酸等 2. 分析某种物质的纯度及分子量 3.电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析 4.免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力 电泳的影响因素 ? 待分离大分子的性质 :所带的电荷、分子大小和形状。 分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则 其电泳迁移速度越快。 ? 电场强度:过高,产热,蛋白变性导致不能分离; 缓冲 液水分蒸发过多,离子强度增加;过低,电泳时间增加, 扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时,需附有 冷却装置。 ? 电渗:在电场中液体对固体支持物的相对移动;当电渗 方向与电泳方向一致时,会加快颗粒泳动速度,反之, 当两者方向相反时,会减慢颗粒泳动速度。 ? 支持介质的筛孔 :筛孔越小,则颗粒在移动的 过程中所受到的阻力也就越大。 ? 缓冲液pH和离子强度:pH值距离其等电点愈远, 其所带净电荷量就越大,电泳的速度也就越大 ; 但是pH过高或过低引起蛋白变性;缓冲液通常 要保持一定的离子强度,强度过低,则缓冲能力 差,不易维持pH恒定,离子强度过高,在待分 离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层 (即离子氛),降低了蛋白质的带电量,使电泳 速度减慢。一般所用离子强度为0.02~0.2之间。 (二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法,由 丙烯酰胺(Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在 催化剂作用下,聚合交联而成的三维网状结构凝胶。 当Acr和Bis遇到自由基时,便能聚合。引发自由基产 生的方法有两种:化学法和光化学法. 1.凝胶聚合催化体系 化学聚合的引发剂是过硫酸胺(简称AP)。在 催化剂N,N,N′,N′-四甲基乙二胺 (简称TEMED) 的作用下,由AP形成氧自由基而引发聚合反应, 由于反应需要TEMED的游离碱基,所以在低pH下, 聚合反应可能延迟甚至被阻止。增加TEMED或过 硫酸铵浓度可以增加聚合反应速度,但速度过快 影响制板操作,两者浓度过高也影响蛋白质活性。 (1)光催化:核黄素 (2)化学催化:AP-TEMED 催化体系 S2O82- 2SO4· ? ? TEMED(四甲基乙二胺)催化AP(过硫酸胺)生成硫酸自由基: ? 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链: ?Bis将单体长链间连成网状结构: 化学聚合的凝胶孔径较小,常用于制备分离胶, 重复性好。聚合反应受各种因素的影响: ? ? ? ? ? 催化剂和加速剂的浓度 pH 温度 分子氧 杂质 碱性条件 2. 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 蛋白分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) ?104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 ?5×105 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5 3.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性 (1) 在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好; (2) 化学性能稳定,与被分离物不起化学反应,很多溶剂中 不溶; (3) 对pH和温度变化较稳定; (4) 几乎无吸附和电渗作用,只要Acr纯度高,操作条件一致, 则样品分离重复性好; (5) 样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达10-6g; (6) 凝胶孔径可调节,根据被分离物的分子量选择合适的浓 度,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径; (7) 分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛 和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、福建体彩网,琼脂糖 电泳等有更高的分辨率。 4.聚丙烯酰胺凝胶种类 (1)连续系统与不连续系统两大类 不连续系统:是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的 电泳方式,在电泳分离过程中,由于浓缩胶的堆积作用,可 使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带,对样品 进行浓缩,然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离, 既存在电荷效应,也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大, 但是它具有连续系统不可比拟的优越性,分辨率高。 (2)常用的多为圆盘电泳和板状电泳,原理完全相同。 (3)不连续体系:电极缓冲液、浓缩胶及分离胶 ? 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液 为pH 6.7的Tris-HC1。 ? 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液 为pH 8.9 Tris-HC1。 ? 电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。 (4) 不连续体系凝胶对蛋白的分离作用 1) 样品浓缩效应 A. 凝胶孔径不连续性 B. 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 C. 电位梯度的不连续性 2) 分子筛效应 3) 电荷效应 三. 实验器材 1、电泳仪,电泳槽及其附件 2、培养皿 3、脱色摇床 4、烧杯 5、移液枪 6、吸量管 7、枪头等 四. 实验试剂 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. (参考P121) 人血清; 分离胶缓冲液:Tris-HCl缓冲液 PH8.9; 浓缩胶缓冲液: Tris-HCl缓冲液 PH6.7; 分离胶贮液:Acr 28.0g,Bis 0.735g,无离子水溶解定容至100ml; 浓缩胶贮液: Acr10.0g,Bis2.5g,无离子水溶解定容至100ml; 1.6% 过硫酸铵溶液: 1.6g 过硫酸铵溶于100ml 无离子水中; 电泳缓冲液: Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3,用时稀释10倍; 1% 考马斯亮蓝G-250;6% 乙酸溶液;40% 蔗糖溶液; 0.1% 溴酚蓝溶液 五. 操作步骤 (一

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